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通過(guò)將熒光技術(shù)引入Western Blotting這一檢測(cè)平臺(tái),實(shí)現(xiàn)了在同一張膜上同時(shí)使用多個(gè)探針,這樣就有機(jī)會(huì)準(zhǔn)確量化和比較每個(gè)相關(guān)條帶的所有信號(hào)。如果某種凝集素與蛋白質(zhì)條帶結(jié)合(共定位),則可精確檢測(cè)出蛋白質(zhì)的糖基化狀態(tài)。第14篇參考文獻(xiàn)中的一張圖表則是一個(gè)利用熒光技術(shù)鑒別 IgG Fc 片段與 Fab 片段糖基化狀態(tài)的很好例子,下面的實(shí)驗(yàn)流程簡(jiǎn)要介紹了這種方法。
精選文獻(xiàn)
• Whole sample protein glycosylation analysis (Ref. 47)
• Determine glycosylation of specific protein(s) (Ref. 30)
• Track glycosylation changes across physiological events (Ref. 28)
實(shí)驗(yàn)流程概覽
樣本制備
• 按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)Western Blotting流程制備樣本;
• 電泳、轉(zhuǎn)膜(建議使用PVDF膜,可以減少背景)。
封閉
• 使用Vectorlabs的CFB溶液(Carbo-Free™ Blocking,SP-5040-125),室溫孵育膜30-60分鐘。或4℃過(guò)夜孵育。
檢測(cè)
• 加入熒光標(biāo)記的凝集素(根據(jù)需求,亦可選擇使用生物素標(biāo)記的凝集素),室溫孵育一小時(shí)或者4℃過(guò)夜孵育;建議凝集素的初始工作濃度為0.5–10ug/ml。具體凝集素的孵育條件和使用濃度需要用戶進(jìn)行優(yōu)化;
• TBST室溫洗膜 5–10 分鐘,4次;
• 加入其他感興趣的熒光標(biāo)記的試劑(一抗或其他凝集素)室溫孵育一小時(shí),或4℃過(guò)夜孵育。
顯色
• 如果使用了生物素標(biāo)記的凝集素,此步驟需要加入熒光標(biāo)記的鏈霉親和素或親和素孵育1小時(shí);
• TBST室溫?fù)u動(dòng)洗膜 5–10 分鐘,2次。
信號(hào)收集
• 將膜進(jìn)行干燥處理;
• 圖像采集。

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