信使核糖核酸（Messenger RNA，mRNA）技術(shù)開(kāi)辟了疫苗學(xué)的新紀(jì)元。這篇綜述簡(jiǎn)要介紹了mRNA疫苗的發(fā)展，以及mRNA與納米遞送系統(tǒng)產(chǎn)生的先天免疫反應(yīng)。

The rise of mRNA vaccines

mRNA疫苗領(lǐng)域在新冠疫情中得到了快速發(fā)展，輝瑞/BioNTech 和Moderna分別研制的兩款mRNA新guan疫苗更首先獲得美國(guó)FDA的緊急使用授權(quán)1，使得mRNA疫苗受到大眾的廣泛關(guān)注。事實(shí)上，mRNA技術(shù)建立在多年的研究基礎(chǔ)之上，其概念驗(yàn)證研究最早可以追溯到三十多年前，當(dāng)時(shí)Wolff et al.注意到將裸mRNA注射到小鼠骨骼肌能夠在小鼠體內(nèi)實(shí)現(xiàn)外源性蛋白的表達(dá)2。之后在1990年代的研究mRNA也被證明可以在體外和體內(nèi)引發(fā)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)3。不過(guò)，礙于mRNA本身結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在體內(nèi)應(yīng)用后很容易降解，以及會(huì)誘發(fā)不必要的先天免疫反應(yīng)3，mRNA技術(shù)有很長(zhǎng)一段時(shí)間被認(rèn)為其臨床應(yīng)用性較低。隨著近十多年科學(xué)的進(jìn)步，這些mRNA疫苗的研發(fā)難點(diǎn)逐漸被克服，例如通過(guò)進(jìn)行化學(xué)修飾使mRNA增加穩(wěn)定性和調(diào)節(jié)免疫原性、使用納米粒子技術(shù)提高mRNA的胞內(nèi)表達(dá)和遞送效率等。其中，脂質(zhì)納米顆粒（LNP）是當(dāng)前最主流的mRNA疫苗的納米遞送系統(tǒng)。LNP-mRNA技術(shù)平臺(tái)現(xiàn)時(shí)已被廣泛應(yīng)用在各種疾病（如癌癥、傳染病或遺傳疾病）的預(yù)防性疫苗或治療性疫苗的臨床前或臨床研究4。

Overcoming the innate immune responses

mRNA是由DNA作為模版轉(zhuǎn)錄而來(lái)、帶有蛋白質(zhì)合成編碼信息的一類單鏈RNA（ssRNA）。合成mRNA可以通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄酶促反應(yīng)（in vitro transcription enzymatic reaction，IVT）產(chǎn)生3。不過(guò)，由于RNA具有天然的免疫刺激特性，在進(jìn)入細(xì)胞時(shí)，外源的體外轉(zhuǎn)錄mRNA會(huì)被機(jī)體免疫防御系統(tǒng)的第一道防線識(shí)別，激活不同的模式識(shí)別受體（PRRs），例如位于內(nèi)體的TLR7/85。而IVT制備過(guò)程除了產(chǎn)生目的產(chǎn)物mRNA本身外，還會(huì)產(chǎn)生各種副產(chǎn)物。其中主要的副產(chǎn)物雙鏈RNA（dsRNA）可以被TLR3和細(xì)胞質(zhì)中的RIG-I/MDA-5特異性識(shí)別5。PRRs對(duì)RNA的感知會(huì)觸發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)生IFN-α和IFN-β等I型干擾素和促炎性細(xì)胞因子（見(jiàn)圖1）5。這些先天免疫激活可以有不良的影響，它們可以抑制mRNA的翻譯和蛋白抗原合成，甚至引發(fā)細(xì)胞死亡，最終降低mRNA疫苗的有效性。

為了克服這種先天免疫應(yīng)答，Kariko? et al.首先嘗試化學(xué)修飾IVT mRNA，他們通過(guò)使用天然存在的假尿苷（Pseudouridine，Ψ）來(lái)替換RNA序列的尿苷堿基6。這種修飾模擬內(nèi)源性mRNA，成功減少了mRNA與機(jī)體的TLR7/8和其他免疫傳感器的結(jié)合，限制I型IFN的過(guò)度產(chǎn)生并提高mRNA的翻譯能力6。除了Ψ，常用的mRNA修飾還有N1-甲基偽尿苷（N1-methylpseudouridine，m1ψ）。研究發(fā)現(xiàn)與ψ修飾相比，引入m1ψ的mRNA序列在增強(qiáng)蛋白表達(dá)的能力和逃脫機(jī)體天然免疫應(yīng)答的表現(xiàn)更好，尤其是在減少TLR3激活反應(yīng)方面7。此外，為了進(jìn)一步避免不必要的先天免疫激活，從IVT mRNA中去除dsRNA雜質(zhì)是非常重要。IVT mRNA的純化方法可以通過(guò)基于微珠的沉淀和色譜方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如高效液相色譜（HPLC）4。

Formulating mRNA with LNPs

經(jīng)修飾的mRNA轉(zhuǎn)錄物可以依靠LNP載體來(lái)保護(hù)其免于被細(xì)胞外的RNA酶（RNAse）降解，協(xié)助其順利進(jìn)入細(xì)胞和內(nèi)體逃逸3。不過(guò)，載體分子也可以與疫苗的免疫原性相關(guān)。LNP通常由不同比例的磷脂、膽固醇、可電離/陽(yáng)離子脂質(zhì)和PEG-脂質(zhì)組成4。盡管磷脂和膽固醇作為天然的細(xì)胞膜成分不太可能觸發(fā)顯著的先天免疫應(yīng)答，但一些可電離/陽(yáng)離子脂質(zhì)可以通過(guò)激活PRR通路誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)8。例如，Lonez et al.發(fā)現(xiàn)diC14-amidine脂質(zhì)體可刺激TLR49；另一種陽(yáng)離子脂質(zhì)RPR206252也被發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)TLR2和NLRP3通路激活炎癥反應(yīng)10。此外，其他成分如PEG被指出可以激活補(bǔ)體系統(tǒng)，觸發(fā)機(jī)體的超敏反應(yīng)。LNP遞送系統(tǒng)的設(shè)計(jì)依然需要持續(xù)優(yōu)化，充分評(píng)估不同組件成分的炎癥性質(zhì)，以調(diào)節(jié)與體內(nèi)的先天免疫系統(tǒng)的相互作用。

Fig. 1: IVT mRNA and dsRNA byproducts-induced immune activation

Innate immune activation assessment

先天免疫感應(yīng)機(jī)制對(duì)mRNA疫苗可能是一把“shuang刃劍"。如上文所述，它可能抑制蛋白表達(dá)或?qū)е逻^(guò)度的炎癥反應(yīng)；不過(guò)，預(yù)防性疫苗或某些類型的癌癥疫苗可能會(huì)受益于其佐劑效應(yīng)12。例如有研究顯示輝瑞/BioNTech的新冠mRNA疫苗BNT162b2在小鼠體內(nèi)通過(guò)MDA-5信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生S蛋白特異性的CD8+ T細(xì)胞13，這種免疫反應(yīng)可能有助提高疫苗效力的持久性。重要的是，mRNA疫苗的成分除了需要精心設(shè)計(jì)，也需要一個(gè)靈敏而強(qiáng)大的平臺(tái)來(lái)評(píng)估它們的免疫原性，以確定mRNA疫苗的初步安全性和有效性。InvivoGen提供了一系列的PRR報(bào)告細(xì)胞，可以幫助測(cè)試納米材料和mRNA制劑的免疫刺激特性，例如我們的HEK293衍生的TLR3和TLR7報(bào)告基因細(xì)胞被Coolen et al.用來(lái)比較兩種不同納米顆粒材料的mRNA疫苗的免疫激活14；Son et al.采用了InvivoGen的HEK293衍生的TLR4和TLR7報(bào)告基因細(xì)胞系來(lái)檢測(cè)不同mRNA納米載體在TLR信號(hào)通路的參與15（產(chǎn)品信息請(qǐng)參見(jiàn)下文）。

References

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Fig 2: TLR Response Profile. HEK-Blue™ reporter cells were stimulated with 1/10 dilution of the sample solution provided and a fixed concentration of positive controls. After 24h incubation, TLR-induced NF-κB activation was assessed by measuring the SEAP levels in cell supernatants using QUANTI-Blue™.

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