根據(jù)下列的免疫細(xì)胞化學(xué)故障排除指南來(lái)快速找出問題原因，改善您的實(shí)驗(yàn)步驟和解決方案。首先從下列選項(xiàng)中找到對(duì)應(yīng)您免疫細(xì)胞化學(xué)染色問題的圖片:

染色較弱或沒有染色	高背景染色	非特異性染色

一、染色較弱或沒有染色：

細(xì)胞從蓋玻片上脫離: 減少洗滌步驟或輕緩洗滌；用多聚賴氨酸將細(xì)胞黏合到蓋玻片上

細(xì)胞沒有被通透: 甲醇和丙酮固定能使細(xì)胞通透性增強(qiáng)；如果使用甲醛, 用0.2% Triton X-100通透細(xì)胞

細(xì)胞失水變干: 在整個(gè)染色過(guò)程中樣品必須保持覆蓋于液體中

細(xì)胞固定過(guò)度: 減少固定時(shí)間

一抗量不夠: 提高抗體濃度；加長(zhǎng)孵育時(shí)間；

孵育時(shí)間太短: 增加一抗和樣品的孵育時(shí)間

切片儲(chǔ)存問題: 樣品處理之后應(yīng)該應(yīng)該馬上成像，不然信號(hào)會(huì)隨時(shí)間推移而減弱。如果需要可以將切片于 4?C 黑暗處儲(chǔ)存。

一抗二抗不兼容: 二抗應(yīng)該是抗一抗宿主的。例如，如果一抗是小鼠來(lái)源的，那就需要用抗小鼠的二抗；亞型需要兼容

一抗不適用: 確保抗體驗(yàn)證過(guò)可以用于ICC；先在免疫印跡中測(cè)試抗體, 確保抗體沒有變質(zhì)

儲(chǔ)存問題: 反復(fù)冷凍/解凍是對(duì)抗體不利的，可引起降解. 最好是在收到產(chǎn)品時(shí)將其分成多個(gè)小份來(lái)保存；抗體沒有按照建議的方式保存. 如果是這樣的話可能需要重新購(gòu)買一支；如果二抗沒有在黑暗處保存 (使用免疫熒光時(shí)), 應(yīng)更換一支新的二抗。

蛋白沒有在檢測(cè)的組織中出現(xiàn): 做一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照；如果目標(biāo)蛋白顯現(xiàn)但是信號(hào)不強(qiáng), 增加一個(gè)擴(kuò)大信號(hào)步驟

二、高背景染色

抗體濃度太高: 稀釋一抗/二抗

非特異結(jié)合: 做一個(gè)沒有一抗的二抗空白對(duì)照.  如果有染色，說(shuō)明二抗有非特異性結(jié)合，更換一種二抗。

阻斷不夠: 增加阻斷孵育時(shí)間或考慮更換阻斷劑。

信號(hào)放大過(guò)度: 減少信號(hào)放大孵育時(shí)間，稀釋二抗

洗滌不充分: 步驟之間的適當(dāng)洗滌非常重要. 確保遵循說(shuō)明說(shuō)上的洗滌步驟。

三、非特異性染色

抗體濃度過(guò)高: 降低抗體的濃度和孵育時(shí)間

一抗產(chǎn)自和待測(cè)樣本來(lái)源同樣的物種 (例. 小鼠抗小鼠): 盡量使用來(lái)自不同物種的一抗.  或者阻斷內(nèi)源IgG.  還可以嘗試在孵育時(shí)使用1% Triton 來(lái)清洗組織.  或用TBS-Tween 20替換 PBS-Tween 20作為洗滌液。

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